Gendiagnostik
Einführung
Zwei Typen von Fragen können (unter anderen) gestellt werden:
- Zu welchem Individuum gehört eine DNA-Probe?
- Ist ein bestimmtes Gen in einer DNA-Probe verändert?
Zu welchem Individuum gehört eine DNA-Probe?
Die Genome verschiedener Individuen sind weitgehend identisch. Man schätzt jedoch, dass auf 300 bis 1000 bp ein Basenpaar nicht identisch ist. Für das ganze Genom ergibt das ca. drei Millionen "individuelle Basenpaare". Untersuchungen haben gezeigt, dass die Unterschiede nicht gleichmässig über das ganze Genom verteilt sind. Es sind bestimmte Regionen der DNA, vor allem repetierte Sequenzen, welche in einzelnen Individuen unterschiedlich sind. Mittels Restriktionsverdauung von DNA und Southern Blotting mit einer radioaktiven DNA-Sonde für die entsprechende repetierte Sequenz, können die Unterschiede sichtbar gemacht werden: RFLP = Restriktionsfragment-Längenpolymorphismus. Mittels PCR
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PCR
Bedeutung: Die Einführung der PCR-Methode Ende der 80er Jahre hat die Anwendungsmöglichkeiten der Gentechnologie revolutioniert. Sie ermöglicht die massive Vermehrung (Amplifizierung) kleinster DNA-Mengen, die sonst der Analyse nicht oder nur schwer zugänglich wären.
Vorgehen:
- Isolierung von DNA: Als Ausgangsmaterial kann das ganze Genom oder ein Teil des Genoms, welches das zu kopierende Genstück enthält, verwendet werden.
- Auftrennen der Doppelstränge in Einzelstränge durch Erhitzen der DNA. Normalerweise liegt die Temperatur um die 90 Grad C.
- Hybridisieren der Primer: Voraussetzung: Man muss die Sequenzen an den Enden des gewünschten DNA-Bereichs kennen, damit man zwei kurze Oligonucleotide (=Primer) synthetisieren kann, die sich an die Ziel-DNA anlagern. Diese Oligonucleotide begrenzen den Abschnitt, der vervielfältigt wird. Sie sind komplementär zu einem kurzen Teil des zu analysierenden Genabschnittes. Um die Primer an die Einzelstränge zu hybridisieren, muss die Temperatur von 90 Grad C auf ca. 45 Grad C reduziert werden. Die optimale Temperatur hängt von der Länge und der Sequenz des Primers ab.
- DNA-Synthese: Als Enzym für die DNA-Synthese wird meist die Thermus aquaticus (Taq)-Polymerase gewählt. Sie ist hitzestabil und ihr Temperaturoptimum liegt bei 70 Grad C. Sie synthetisiert den neuen Strang in 5'-3'-Richtung.
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SSCP-Analyse(single strand conformational polymorphism)
- Prinzip: DNA-Einzelstränge falten auf sich selber zurück und bilden eine Struktur, welche für jede Basensequenz einmalig ist. Unterschiedlich gefaltete DNA-Stränge können mittels Gelelektrophorese getrennt werden.
- Anwendung: Identifikation von Mutationen. Southern Blotting ist eine Methode zur Uebertragung von DNA-Banden aus einem Gel auf eine Membran aus Nitrozellulose oder aus einem ähnlichen Material.
Anwendung: Gerichtsmedizin: Spurenanalyse, Vaterschaftsanalyse
An dieser Stelle das Video "Genkrimi".
Ist ein bestimmtes Gen in einer DNA-Probe verändert?
Bei dieser Fragestellung geht es darum, ein Gen oder eine Region eines Gens für einen bekannten Defekt (Punktmutation, Deletion, Addition) abzusuchen.
Anwendung: Pränatale Diagnostik: Erbkrankheiten
Beispiele: Hämoglobin S, Muskeldystrophie,Cystische Fibrose (siehe weiter unten)
Postnatale Diagnostik: Erbkrankheiten. In der postnatalen Diagnostik kann auch die Frage gestellt werden, ob fremde DNA in der DNA-Probe vorhanden ist, z.B. bei bakteriellen und viralen Infektionen.
Weil das humane Genom sequenziert ist, wird die prä- und postnatale Diagnostik ständig erweitert werden.
Genomics, Proteomics
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Genomics, ProteomicsDas menschliche Erbmaterial ist sequenziert!
Am 26. Juni 2000 gab der amerikanische Präsident Bill Clinton im Weissen Haus (Washington, USA) zusammen mit Francis Collins und Craig Venter die (fast) vollständige Sequenzierung des menschlichen Erbgutes bekannt!
Früher als erwartet geht damit ein Wettlauf zwischen einer privaten Firma (Celera Genomics, unter Craig Venter) und dem von öffentlichen Geldern unterstützten HUGO Projekt (Human Genome Organization, unter Francis Collins) zu Ende.
Allerdings ist mit der Aufklärung der Abfolge der Bausteine im Erbmaterial des Menschen erst der Anfang zum Verständnis der Funktionsweise unserer Gene gemacht. Nun geht es darum, die Funktionen der einzelnen Eiweisse zu verstehen!
Genomics
Fragestellung
- Welche Gene einer Zelle werden als mRNA exprimiert?
Experimentelles Vorgehen:
Limitierung: Wir wissen nun zwar, welche mRNAs eine Zelle macht, aber wir wissen nicht, ob und wieviel der entsprechenden Proteine gemacht werden.
Proteomics
Fragestellung
- Welche Proteine werden in einer Zelle gemacht?
Experimentelles Vorgehen:
Limitierung: Diese Technologie ist noch aufwendig und nicht soweit entwickelt, dass alle Proteine einer Zelle erfasst werden können.
Structural proteomics
Fragestellung:
- Welche 3-dimensionalen Strukturen haben die Proteine einer Zelle?
Experimentelles Vorgehen: Kristallisation von Proteinen und Bestimmung der 3-dimensionalen Strukturen mittels Röntgen-Analyse. Ableitung der 3-dimensionalen Strukturen verwandter Proteine (ähnliche Aminosäuresequenz) mit dem Computer.
Das Verständnis der Struktur eines Proteins erleichtert die Analyse der Funktion und ermöglicht die Entwicklung von synthetischen Molekülen, die die Funktion des Proteins beeinflussen - eine wichtige Anwendung in der Pharmaforschung!
Ziele, Hoffnungen
- Charakterisierung von Zellen und Geweben in Bezug auf die exprimierten Proteine
- Korrelierung von Krankheiten mit Veränderungen der Proteinexpression
- Gezielte Eingriffe in die Regulation der Aktivität von Proteinen
Pränatale Diagnostik
Unter pränataler Diagnostik versteht man die vorgeburtliche Erfassung von Erbkrankheiten.
Aus der ursprünglichen Schwangerschaftsvorsorge ist in den letzten Jahren eine eigenständige medizinische Disziplin entstanden, die sich um das Wohlergehen des werdenden Kindes bemüht. Die pränatale Diagnostik verwendet nicht-invasive und invasive Methoden.
Nicht-invasive Methoden:
Zu den nicht invasiven Methoden zählt die Ultraschalldiagnostik. Sie hat ihre Bedeutung nicht nur im Hinblick auf das Erfassen möglicher Missbildungen, sondern gilt heute als Standardverfahren zur Schwangerschaftsüberwachung. Sie liefert neben wichtigen geburtshilflichen Daten immer auch Informationen über mögliche foetale Missbildungen. Schwerere Missbildungen können mit Hilfe der Ultraschalltechnik in der frühen Schwangerschaft erfasst werden. So zum Beispiel Anencephalus (fehlende Grosshirnanlage), Spina bifida (offener Röcken), Zwerchfellmissbildungen, Herzfehler. In der späten Schwangerschaft sind sogar Defekte, wie zum Beispiel die Lippen-Kiefer-Gaumen-Spalte oder das Down-Syndrom, feststellbar.
Invasive Methoden:
a) Amniozentese:
Unter Amniozentese versteht man die transabdominale Fruchtwasserpunktion in der 16.-20. Schwangerschaftswoche. Mit einer langen Nadel wird durch die Bauchdecke der Mutter hindurch Fruchtwasser entnommen. Im Fruchtwasser schwimmen abgeschilferte Zellen des Embryos. Diese Zellen können kultiviert und einer Chromosomenanalyse unterzogen werden. Auf diese Weise können Chromosomenstörungen, wie zum Beispiel die Trisomie 21, diagnostiziert werden. Der ganze Vorgang der Kultivierung und der Analyse dauert zwei bis drei Wochen. Der Hauptnachteil der Amniozentese liegt darin, dass sie in der Regel erst in der 15.-16. Schwangerschaftswoche durchgeführt werden kann und das Ergebnis zu einem Zeitpunkt vorliegt, an dem die Schwangere bereits Kindsbewegungen verspürt hat. Entscheiden sich die Eltern nach Diagnose eines schweren und unheilbaren kindlichen Leidens für eine Beendigung der Schwangerschaft, muss ein medizinisch und vor allem psychologisch sehr belastender Abbruch im zweiten Trimenon durchgeführt werden. Als Methode zur Pränataldiagnostik bereits im ersten Trimenon kommen zur Zeit nur die Chorionzottenbiopsie bzw. die Früh-Amniozentese in Frage.
b) Chorionbiopsie:
In den letzten Jahren wird zunehmend die Chorionbiopsie durchgeführt. Dabei wird Gewebe aus dem kindlichen Anteil der Plazenta untersucht. Choriongewebe kann auf zwei Arten gewonnen werden: vaginal, d.h. durch die Scheide und den Gebärmutterhals, oder transabdominal, d.h. durch die Bauchdecke. Beide Techniken werden unter Ultraschallkontrolle durchgeführt. Bei der Chorionbiopsie entfällt die Kultivierung der Zellen, so dass das Resultat in spätestens einer Woche nach der Untersuchung vorliegt. Zudem wird diese Technik wesentlich früher in der Schwangerschaft angewendet, in der 8.-10. Schwangerschaftswoche.
Beide Methoden, die Amniozentese und die Chorionbiopsie, haben je nach Quellen ein Abortrisiko von 1-3%.
Hier ein Video zur Amniozentese und Choronbiopsie
Muskeldystrophie Duchenne (DMD)
Die wichtigsten Angaben zur Muskeldystrophie Duchenne:
Klinik: Schwere, progredient verlaufende Muskelerkrankung. Die Duchenne-Muskeldystrophie (DMD) und die wesentlich mildere Verlaufsform nach Becker (BMD) entstehen durch Mutationen des Muskelproteins Dystrophin, dessen Gen auf dem X-Chromosom lokalisiert ist. Erste Symptome mit drei bis fünf Jahren. Rollstuhlabhängigkeit mit ca. zwölf Jahren. Lebenserwartung kaum mehr als zwanzig Jahre. Zur Zeit noch keine kausale Therapie. Häufigkeit: 1:3500 (männliche Geburten). Erbgang: geschlechtsgebundener, rezessiver Erbgang. Gen: auf X-Chromosom. 2,5 . 10 hoch 6 Basenpaare, grösstes zur Zeit bekanntes Gen mit 65 Exons. mRNA: ca. 14 000 Basen lang. Genprodukt: Dystrophin, Molekulargewicht 400 000 Dalton. Defekt: Deletion eines Teils des Gens. Der Unterschied zwischen BMD und DMD liegt darin, dass im Falle der DMD Deletionen im Dystrophin-Gen zu Verschiebungen des Leserasters und zum Kettenabbruch führen, während im Falle der BMD, trotz einer Deletion (z.B. eines ganzen Exons) der offene Leseraster des Gens korrekt weitergeführt wird: es resultiert ein Protein mit eingeschränkter Funktion.
Die Funktion des Dystrophins besteht nach gegenwärtigen Vorstellungen in einer Verankerung von Actin-Filamenten an Membranproteinen des Sarkolems. Der Verlust dieser Funktion scheint für die Degeneration des Muskelgewebes verantwortlich zu sein. Auch das Myocard (Herzmuskel) ist betroffen.
Hier ein Video zur "Duchenne Muskeldystrophie":
Zur Illustration der Diagnose "Duchenne Muskeldystrophie" können Sie einen Fall bearbeiten:
Hat das Genom des Foeten die Deletion, die zu DMD führen wird?
Vorgehen:
- Entnahme von Zellen des Foeten: siehe Amniozentese oder Video "Amniozentese, Chorionzottenbiopsie"
- DNA-Isolation: siehe "Chemie der Nukleinsäuren" und Video "DNA-Isolierung"
- Schneiden mit Restriktionsenzymen
- Southern
Blotting
XSouthern Blotting
Southern Blotting ist eine Methode zur Uebertragung von DNA-Banden aus einem Gel auf eine Membran aus Nitrozellulose oder aus einem ähnlichen Material.
Prinzip:
- Identifizierung bestimmter Sequenzen des menschlichen Genoms, die durch ein Restriktionsenzym in von Individuum zu Individuum unterschiedliche Fragmente gespalten werden.
Vorgehen:
- Ausgangsmaterial: Via Chorionbiopsie oder Amniozentese werden Zellen des Fötus entnommen.
- DNA-Isolierung: Video
- Schneiden der DNA mit Restriktionsenzymen: Video
- Trennung der DNA-Fragmente mittels Gelelektrophorese: die Stücke werden nach der Länge aufgetrennt.
- Auftrennen der Doppelstränge: Das Gel mit den elektrophoretisch aufgetrennten DNA-Fragmenten wird für einige Zeit in Natronlauge gelegt, um die doppelsträngigen Fragmente in Einzelstränge aufzutrennen ("DNA-Denaturierung").
- Uebertragung auf Nitrozellulosefilter: Man legt eine Membran auf das Gel und saugt eine Pufferlösung hindurch, welche die DNA mitzieht und aus dem Gel auf die Membran berträgt, wo die Fragmente gebunden werden. Das Resultat ist eine Membran mit einem "Abklatsch" der DNA-Banden aus dem Agarose-Gel.
- Hybridisierung mit Gen-Sonde: Die Hybridisierung ist eigentlich eine DNA-Renaturierung. Die gesuchte DNA basenpaart mit der radioaktiv markierten Gensonde. Als Gensonden werden cDNA-Stücke oder genomische DNA-Stücke verwendet. Welches sind die Voraussetzungen für eine Hybridisierung? Es muss eine Gen-Sonde (siehe DNA-Klonierung) vorhanden sein, die das Gen abdeckt oder, bei grossen Genen, mit einem Teil des Gens hybridisieren kann. Dafür muss das ganze Gen oder, was oft der Fall ist, ein Teil des Gens bekannt sein.
- Sichtbarmachen der hybridisierten Fragmente auf dem Röntgenfilm: Jetzt wird das Bandenmuster sichtbar, das für ein bestimmtes Gen, welches mit einem ausgewählten Restriktionsenzym geschnitten wurde, charakteristisch ist. Das Bandenmuster auf dem entwickelten Röntgenfilm nennt man ein Autoradiogramm.
- Hybridisierung:
Video: Prinzip der Hybridisierung (2D-Animation); Ausschnitt aus Video "Hybridisierung".
Video: Elektrophorese; Ausschnitt aus Video "Hybridisierung".
Video: Southern-Blotting; Ausschnitt aus Video "Hybridisierung".
Video: Gensonde; Ausschnitt aus Video "Hybridisierung".
Video: RX belichten; Ausschnitt aus Video "Hybridisierung".
Video: Banden ablesen; Ausschnitt aus Video "Hybridisierung".
Lösung der Problemstellung
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Lösung der Problemstellung (DMD)
Befund: Exon 4 fehlt beim Foetus. Der Junge wird an DMD erkranken.
Video: Banden Autodiagramm ablesen; Ausschnitt aus Video "Hybridisierung".
Cystische Fibrose (CF)
Wichtigste Angaben zur Cystischen Fibrose:
Klinik: Funktionsstörung der exokrinen mukösen Drüsen. Lunge: chronische Bronchitiden, rezidivierende Pneumonien. Verdauungsorgane: Pankreasinsuffizienz führt zu Maldigestionen und Malabsorption. Meconium-Ileus, Diabetes mellitus, Leberzirrhose. Häufigkeit: Häufigste Erbkrankheit mit letalem Ausgang in der kaukasischen Bevölkerung, 1 auf 2000 Lebendgeburten, 1 auf 21 Personen ist Träger der Mutation (ca. 5% der Bevölkerung). Erbgang: autosomal rezessiv. Gen: liegt auf Chromosom 7; 27 Exons, 250 000 Basenpaare. Genprodukt: CFTR (Cystic fibrosis transmembrane conductance regulator) = Chlorid-Kanal in der Zellmembran. Defekt: Deletion eines Basentripletts in Exon 10 (häufigste Mutation; insgesamt etwa 180 Mutationen bekannt)
Zur Illustration der Diagnose "Cystische Fibrose" können Sie einen Fall bearbeiten:
- Ist der Foetus gesund oder krank?
- Ist der gesunde Bruder des Patienten Träger des Gens?
Vorgehen:
- Entnahme von Zellen des Foeten (siehe Amniozentese oder Video "Amniozentese, Chorionzottenbiopsie") und Zellen des gesunden Bruders
- DNA-Isolation: Video: Prinzip der DNA-Isolierung; Ausschnitt aus Video "DNA-Isolierung".
- PCR
= Polymerase Chain ReactionXPCR
Bedeutung: Die Einführung der PCR-Methode Ende der 80er Jahre hat die Anwendungsmöglichkeiten der Gentechnologie revolutioniert. Sie ermöglicht die massive Vermehrung (Amplifizierung) kleinster DNA-Mengen, die sonst der Analyse nicht oder nur schwer zugänglich wären.
Vorgehen:
- Isolierung von DNA: Als Ausgangsmaterial kann das ganze Genom oder ein Teil des Genoms, welches das zu kopierende Genstück enthält, verwendet werden.
- Auftrennen der Doppelstränge in Einzelstränge durch Erhitzen der DNA. Normalerweise liegt die Temperatur um die 90 Grad C.
- Hybridisieren der Primer: Voraussetzung: Man muss die Sequenzen an den Enden des gewünschten DNA-Bereichs kennen, damit man zwei kurze Oligonucleotide (=Primer) synthetisieren kann, die sich an die Ziel-DNA anlagern. Diese Oligonucleotide begrenzen den Abschnitt, der vervielfältigt wird. Sie sind komplementär zu einem kurzen Teil des zu analysierenden Genabschnittes. Um die Primer an die Einzelstränge zu hybridisieren, muss die Temperatur von 90 Grad C auf ca. 45 Grad C reduziert werden. Die optimale Temperatur hängt von der Länge und der Sequenz des Primers ab.
- DNA-Synthese: Als Enzym für die DNA-Synthese wird meist die Thermus aquaticus (Taq)-Polymerase gewählt. Sie ist hitzestabil und ihr Temperaturoptimum liegt bei 70 Grad C. Sie synthetisiert den neuen Strang in 5'-3'-Richtung.
Video: Prinzip der PCR (2D-Animation); Ausschnitt aus Video "PCR".
- Gelanalyse der DNA-Fragmente Video: Prinzip der Hybridisierung (2D-Animation); Ausschnitt aus Video " Hybridisierung".
Lösung der Problemstellung
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Lösung der Problemstellung (CF)
Antworten:
Der Foetus wird gesund sein, ist jedoch Träger der Deletion. Der gesunde Bruder ist nicht Träger der Deletion.
Erklärung:
Das lange DNA-Fragment (hier 98 Basenpaare lang) erscheint, wenn beide Allele (Genkopien auf beiden Chromosomen eines Chromosomenpaares) normal sind, d.h. hier ohne Deletion der drei Basenpaare. Falls beide Allele abnormal sind, also die Deletion aufweisen, erscheint das kurze DNA-Fragment (hier 95 Basenpaare lang). Liegen beide Allele vor, ist die betreffende Person heterozygot (d.h. Träger der Deletion) und gesund.