Restriktionsendonucleasen
Restriktionsendonucleasen sind Enzyme, welche DNA sequenzspezifisch spalten.
Restriktionsenzyme werden benötigt, um DNA an bestimmten Stellen zu zerschneiden. Sie erkennen spezifische Sequenzen von 4 bis 6 Nucleotiden und spalten dort die Phosphodiesterbrücken. Sie können DNA glatt inmitten ihrer Erkennungsstelle spalten und so stumpf endende Fragmente erzeugen. Andere schneiden den Doppelstrang versetzt, so dass kurze Einzelstrang-Schwänze mit spezifischer Sequenz entstehen ("klebrige" Enden). Durch Ligation können die einzelnen Fragmente untereinander verbunden werden.
Heute kennt man über 800 verschiedene Restriktionsenzyme mit unterschiedlichen Erkennungssequenzen. Diese Enzyme können je nach Bedarf bei entsprechenden Firmen eingekauft werden. Restriktionsenzyme werden aus Mikroorganismen gewonnen.
Beispiele einiger häufig benutzter Restriktionsenzyme und ihre Erkennungssequenzen:
| Enzym | Organismus | Erkennungssequenz | Form der Enden |
|---|---|---|---|
| Pvul | Proteus vulgaris | CGATCG | klebrig |
| Pvull | Proteus vulgaris | CAGCTG | glatt |
| EcoRl | Proteus vulgaris | GAATTC | klebrig |
| BamHl | Bacillus amyloliquefaciens | GGATCC | klebrig |
| Hinfl | Haemophilus influenzae | GANTC | klebrig |
| Sau3A | Staphylococcus aureus | GATC | klebrig |
| HaeIII | Haemophilus aegyptius | GGCC | glatt |
Die angegebene Sequenz entspricht der eines Stranges in der 5'-3'-Richtung. Bemerkenswert ist, dass fast alle Erkennungssequenzen Palindrome sind: Wenn man beide Stränge betrachtet, lesen sie sich in beiden Richtungen gleich, zum Beispiel:
Video: Prinzip der Gen-Klonierung (2D-Animation); Ausschnitt aus Video "Gen-Klonierung".
Video: 1. Restriktion; Ausschnitt aus Video "Gen-Klonierung".
Biologische Bedeutung der Restriktionsenzyme
Mikroorganismen benutzen Restriktionsenzyme als "Abwehrmechanismus", um sich vor dem Eindringen fremder DNA zu schützen. Gelangt fremde DNA, beispielsweise durch eine Phagen-Infektion, in ein Bakterium, wird diese durch die Restriktionsenzyme der Zelle in kleine, funktionslose Fragmente zerlegt.
Wieso wird die zelleigene DNA von den Restriktionsenzymen nicht zerschnitten?
Mehr über Phagen.
Die verschiedenen Typen von Restriktionsenzymen
Es gibt drei Typen von Restriktionsendonucleasen, die man mit I, II und III kennzeichnet. Die Typen I und III sind im allgemeinen grosse Enzym-Komplexe aus vielen Untereinheiten mit sowohl Endonuclease- als auch Methylase-Aktivität. Restriktionsendonucleasen des Typ I spalten die DNA an zufälligen Stellen, die sich 1000 Basenpaare oder weiter von der Erkennungssequenz entfernt befinden können. Die Enzyme des Typs III spalten die DNA etwa 25 Basenpaare von der Erkennungssequenz entfernt. Beide Enzymtypen bewegen sich in einer Reaktion, die ATP-Energie verbraucht, an der DNA entlang. Die Restriktionsenzyme des Typs II, die zuerst von Hamilton Smith isoliert wurden, sind einfacher, erfordern kein ATP und spalten die DNA innerhalb der Erkennungssequenz.
Die aussergewöhnliche Nützlichkeit der Typ-II-Enzyme wurde zuerst von Daniel Nathans aufgezeigt. Sie sind die bei Arbeiten mit rekombinierter DNA am häufigsten verwendeten Enzyme.
Nomenklatur der Restriktionsenzyme
Die ersten Buchstaben stehen für den Namen des Organismus, aus welchem das Enzym isoliert wird. Die vierte Ziffer gibt an, um welchen Stamm es sich handelt. Dort, wo mehr als ein Restriktionsenzym in einem Stamm gefunden wurde, werden diese mit römischen Zahlen numeriert.
Bsp. Eco RI ist das erste Restriktionsenzym, das in E. coli aus dem Stamm R isoliert wurde.