Ligation / Transformation / DNA-Banken
Ligation
Unter Ligation versteht man das Verknüpfen von DNA-Fragmenten mit dem Enzym DNA-Ligase.
DNAs mit komplementären einzelsträngigen Enden können über diese Basenpaarung eingehen. Sie werden deshalb als kohäsiv oder klebrig bezeichnet. Ueber diese Enden können DNAs durch die DNA-Ligase fest verbunden werden. Die DNA-Ligase katalysiert die Bildung neuer Phosphodiesterbrücken.
Da Basenpaarung nur zwischen komplementären Sequenzen möglich ist, können von einem Restriktionsenzym erzeugte kohäsive Enden nicht mit den von einem anderen Enzym erzeugten Enden paaren, es sei denn, dieses andere Enzym erzeugt die gleichen klebrigen Enden. Doch zwei beliebige, von demselben Enzym erzeugte Fragmente können, ungeachtet ihrer unterschiedlichen Herkunft, miteinander "verkleben".
Die Ligation wird bei 10 bis 15 Grad C durchgeführt. Bei dieser relativ tiefen Temperatur ist gewährleistet, dass die beiden komplementären Enden Basenpaare ausbilden und das Enzym (Ligase) noch arbeitet.
Vorbereitung von cDNA für die Ligation
Weil die doppelsträngige cDNA stumpfe Enden hat, muss auch das Plasmid stumpf geschnitten und cDNA und Plasmid stumpf ligiert werden. Da dies nicht sehr effizient geht, werden oft Linker verwendet.Linker sind kleine doppelsträngige DNA-Stücke mit bekannter Sequenz (Restriktions-Schnittstellen), die man im Reagenzglas synthetisiert hat. Die Linker werden mit Hilfe der DNA-Ligase an die doppelsträngige cDNA geknüpft und mit einem Restriktionsenzym geschnitten. Die cDNA, die nun klebrige Enden hat, baut man in einen Vektor ein, der zuvor mit demselben Enzym geschnitten wurde:
Video: 2. Ligation; Ausschnitt aus Video "Gen-Klonierung".
Transformation
Unter Transformation, im Zusammenhang mit rekombinanter DNA, versteht man das Einbringen von DNA in eine Zelle.→Hinweis: Hier werden nur Bakterien betrachtet. Für höhere Zellen, siehe Methoden des Gentransfers beim Menschen.
Wie bringt man DNA in lebende Zellen?
Kompetente Bakterien
Die meisten Bakterien, darunter auch E.coli, nehmen DNA unter normalen Bedingungen nur in begrenztem Umfang auf. Um diese Bakterien wirksam zu transformieren, muss man die Zellen physikalisch und/oder chemisch behandeln. So wird ihre Fähigkeit verstärkt, DNA aufzunehmen. Zellen, die eine solche Behandlung durchlaufen haben, bezeichnet man als kompetent.Transformation von Bakterien
Um DNA in E.coli-Zellen einzubringen, muss die Zellmembran für Makromoleküle permeabel gemacht werden. Dazu inkubiert man die Bakterienzellen mit Kalziumchlorid (CaCl2) bei 0 Grad C. Aus nicht vollständig bekannten Gründen werden die so behandelten Zellen "kompetent", d.h. sie nehmen bei 0 Grad C DNA auf. Dieser Vorgang ist sehr ineffizient, denn nur jede tausendste Zelle wird transformiert. Durch einen Hitzeschock bei 37 bis 43 Grad C wird die Aufnahme von DNA gestoppt.Video: 3. Transformation; Ausschnitt aus Video "Gen-Klonierung".
DNA-Banken
Genomische Banken
Nun werden die transformierten Zellen auf einem mit Antibiotika behandelten Nährmedium ausgestrichen und mittels Inkubation bei 37 Grad C vermehrt. Auf diesem Nährmedium können nur diejenigen Bakterien überleben, die das Resistenzgen für das Antibiotikum besitzen und somit ein Plasmid aufgenommen haben. Aus jedem Bakterium entsteht so ein Klon.
Merke:
- Ein Klon ist eine Gruppe oder Kolonie von genetisch identischen Organismen.
- Eine Genbank ist eine Sammlung von Klonen, die mit grosser Wahrscheinlichkeit jedes Gen eines bestimmten Organismus enthalten.
Die Fragmente in der genomischen Bank eines höheren Eukaryonten enthalten nicht nur Gene, sondern auch die nichtcodierende DNA, die einen grossen Teil vieler eukaryontischer Genome ausmacht.
Video: 4. Bakterien-Vermehrung: DNA-Bank; Ausschnitt aus Video "Gen-Klonierung".
cDNA-Banken
Eine cDNA-Bank ist eine Sammlung von Klonen, die für jede mRNA-Sequenz kodieren, die in der Zelle, aus der die mRNA isoliert wurde, exprimiert werden.