Isolierung von Genen
Methoden zur Isolation eines Klons
Nucleinsäure-Hybridisierung
Prinzip:
- Zwei Nucleotidstränge, welche komplementäre Basen tragen, können sich zusammenlagern und einen Doppelstrang bilden. Diese Hybride können auch dann stabil sein, wenn einzelne Nucleotide nicht zusammenpassen. Es spielt keine Rolle, ob es sich bei den Strängen um RNA oder DNA handelt.
Gen-Sonden:
- Eine Sonde ist eine Nukleotid-Sequenz, die für eine Hybridisierung, d.h. zum Nachweis einer komplementären Sequenz in einer Nucleinsäureprobe eingesetzt wird.
- Es kann eine klonierte cDNA zur Isolierung des Gens eingesetzt werden.
- Ist die Aminosäuresequenz des Proteins, das vom gesuchten Gen codiert wird, bekannt, kann man anhand des genetischen Codes die Nucleotidsequenz des dazugehörigen Gens ableiten. Das künstliche Gen, das so synthetisiert wird, ist nur teilweise komplementär zur gesuchten DNA, da eine Aminosäure oft von mehreren Codons bestimmt wird. Bsp: Die Codons für die Aminosäure Alanin sind GCA, GCT, GCG und GCC. Zwei der drei Nucleotide im Codon für Alanin können mit Sicherheit vorhergesagt werden. Ein künstlich erzeugtes Gen hat in der Regel genügend Aehnlichkeit, um als Sonde eingesetzt werden zu können:
- Gehört das gesuchte Gen zu einer Genfamilie, kann ein anderes Gen aus dieser Familie als Sonde verwendet werden, da diese Gene oft genügend Sequenzidentität haben.
- Die Klone werden auf eine Nitrozellulose- oder Nylonmembran aufgetragen und dort lysiert. Die DNA wird auf der Membran denaturiert, d.h. es entstehen DNA-Einzelstränge. Diese werden mit ihrem Zucker-Phosphat-Rückgrat fest an die Membran gebunden. Die markierten Sonden werden zugegeben. Sie hybridisieren mit den DNA-Einzelsträngen. Die Membran wird gewaschen, um die nichtgebundenen Sonden zu entfernen. Die Lage der gebundenen Sonden wird nachgewiesen.
Markierung der Sonden:
- Einbau von radioaktiven Nucleotiden. Die Bindung der Nucleotide an die Sonde kann durch Autoradiographie nachgewiesen werden.
- Einbau von Nucleotiden, an welche Biotin gekoppelt wurde. Biotin hat eine hohe Affinität zum Protein Avidin. Nach dem Hybridisieren mit der biotinylierten Nucleotidsonde wird die Membran mit Avidin gewaschen. Avidin wird zuvor mit einem Fluoreszenz-Marker gekoppelt und kann so sichtbar gemacht werden.
Video: Hybridisierung im Labor
Immunscreening
Man identifiziert mit Antikörpern das Protein, das vom gesuchten Gen codiert wird. Voraussetzung: Das Gen muss von der transformierten Zelle exprimiert werden.
