Details zur DNA-Isolation
1. Beschaffen von Zellmaterial
Im folgenden Abschnitt wird die Isolation von DNA am Beispiel von menschlicher DNA illustriert. Der erste Schritt beim Analysieren von DNA ist das Beschaffen von Zellmaterial. Je nach Zweck der Untersuchung, pränatale Diagnostik oder Routinetests bei Erwachsenen, eignen sich dazu die Chorionbiopsie, die Amniozentese (Fruchtwasserpunktion) oder eine einfache Blutentnahme.
Chorionbiopsie (8. -12. Schwangerschaftswoche, SSW)
Vorteil: Ergebnis innert einer Woche, weil keine Kultivierung der Zellen nötig
Nachteil: Erhöhtes Abortrisiko
Amniozentese (16. - 20. SSW)
Vorteil: geringes Abortrisiko
Nachteil: Ergebnis erst nach 3 bis 4 Wochen; Diagnose sehr spät (4. - 5. Monat !)
Blutentnahme
Der zelluläre Anteil des Bluts besteht zum grössten Teil aus roten Blutkörperchen (Erythrocyten). Diese sind aber für eine DNA-Isolierung ungeeignet, da sie keinen Kern - und damit kein Erbmaterial - besitzen. Weisse Blutkörperchen (Leukocyten) sind zwar in geringerer Zahl enthalten, dafür aber leicht zu gewinnen.
Mehr zu Chorionbiopsie und Amniozentese im Kapitel "Gendiagnostik".
2. Aufschliessen der Zellen
Zugabe von hypotonem Puffer zur Suspension mit freien Zellen bringt die Zellmembranen aus osmotischen Gründen zum Platzen. Eventuell werden noch DNase - Inhibitoren hinzugegeben (Verhindern der Hydrolyse der DNA!).
Freie Zellen lassen sich also sehr schnell und einfach aufschliessen. Wie dieser Schritt bei tierischen Geweben oder bei Bakterienzellen vor sich geht, können Sie im folgenden Abschnitt entnehmen:
Aufschliessen der Zellen bei tierischen Geweben oder bei Bakterienzellen
3. Unlösliche Teile abzentrifugieren
Das Lysat wird zentrifugiert:
- die Zelltrümmer liegen nun im Überstand und werden entfernt
- die Leukocytenkerne liegen im Sediment
4. Nukleinsäuren von Proteinen trennen und reinigen
a) Zugabe des Detergenz SDS (Sodium-Dodecyl-Sulfat). SDS ist ein ionisches Detergenz (Substanz mit hydrophilem und hydrophobem Teil; Seife), ist bei neutralem pH negativ geladen und hebt die ionischen Interaktionen zwischen Nukleinsäuren und Proteinen auf: Die Kernmembran wird also aufgelöst und die Proteine von den Nukleinsäuren gelöst.
Eine [Auswahl von Proteinen:!auswahlproteine], welche an Nukleinsäuren gebunden sind (ohne Besprechung der genaueren Bedeutung).
b)
Zugabe von Proteinase K: Die Proteine werden hydrolysiert
c)
Zugabe von Phenol, einem organischen Lösungsmittel (hydrophob), zur Denaturierung der noch übriggebliebenen Proteine -> die Proteine verklumpen
[Denaturierung:!denaturierung]
5. Wässrige Phase sammeln
Durch die Zentrifugation werden die organische und die wässrige Phase voneinander getrennt. Proteinaggregate liegen in der Interphase, die hydrophilen Nukleinsäuren (DNA und RNA) in der wässrigen Phase können nun abpipetiert werden.
6. Nukleinsäuren mit Alkoholen fällen
Die Nukleinsäuren sind noch mit andern wasserlöslichen Komponenten verunreinigt und stark verdünnt. Durch Ausfällung mit Alkoholen (Aethanol oder Isopropanol) werden die Nukleinsäuren weiter gereinigt. Um eine bessere Ausfällung zu erhalten, wird vor der Alkoholzugabe NaCl zugegeben. Die Natrium-lonen neutralisieren die negativen Ladungen der DNA, so dass die Fällung leichter wird. H-lonen bewirken dasselbe wie Na-lonen, (allerdings in geringerem Ausmass), weshalb ein tiefes pH die Ausfällung begünstigt.
7. Nukleinsäuren in Puffer lösen
Die Nukleinsäuren liegen nun als Aggregate vor. Um mit ihnen arbeiten zu können, müssen sie in Pufferlösung wieder gelöst werden.
8. DNA und RNA trennen
Dieser Schritt muss nicht zwingend als letztes gemacht werden:
- Zugabe von RNasen oder DNasen (je nach Problemstellung) oder
- Dichtegradientenzentrifugation