Replikations - Elemente
Die Replikationsgabel
Die Replikation beginnt an einem Startpunkt. Sie kann uni- oder bidirektional erfolgen, je nachdem ob sich eine oder zwei Replikationsgabeln vom Startpunkt (Origin) wegbewegen. Bei der bidirektionalen Replikation bewegen sich die beiden Replikationsgabeln in entgegengesetzter Richtung:
Schema
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Mittels radioaktivem Thymin im Nährmedium (Experiment) fand John Cairns heraus, dass an einem oder beiden Enden der gebildeten Replikationsgabel die Elternstränge entspiralisiert und die aufgetrennten Stränge rasch repliziert werden.
Experiment von John Cairns
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Experiment von John CairnsJohn Cairns gelang es, mittels der Technik der Autoradiographie die Replikation als hochgradig koordinierten Vorgang zu beschreiben, bei dem die Elternstränge aufgewunden und gleichzeitig repliziert werden. Er erzeugte radioaktiv markierte DNA in E. coli Zellen, indem er sie in einem Nährmedium kultivierte, welches an Stelle des normalen Thymins das mit Tritium (3H) markierte Thymin enthielt. Er isolierte diese DNA, liess sie sich auf einem Elektronenmikroskop-Objektträger ausbreiten und überschichtete sie mit einer photographischen Emulsion. Binnen mehrerer Wochen erzeugten die radioaktiv markierten Thyminreste Bahnen aus Silberkörnchen, welche ein Abbild der DNA darstellten. Diese Bahnen zeigten, dass die DNA von E. coli aus einem einzelnen ringförmigen Molekül mit einer Länge von 1.7 mm besteht. Die radioaktiv markierte DNA, die während der Replikation aus der Zelle isoliert worden war, wies eine zusätzliche Schleife auf. Auf Grund des Vergleiches der DNA-Mengen in den Schleifen führte Cairns die zweite Schleife darauf zurück, dass zwei zu den Elternsträngen komplementäre Tochterstränge gebildet worden waren.
DNA - Polymerasen
In der Replikationsgabel synthetisiert ein Multienzymkomplex die beiden Tochterstränge. Dieser Enzymkomplex enthält neben anderen Proteinen die DNA - Polymerasen, welche Desoxynukleotide zu langen Polynukleotidketten verknüpfen. Das Bakterium E. coli enthält drei verschiedene DNA - Polymerasen, die meisten eukaryontischen Zellen dagegen deren fünf oder mehr, die sich in ihrer Struktur und Funktion unterscheiden.
Zu: "Korrekturlese"-Mechanismus der DNA-Polymerase (Kapitel: Mutationen, Mutagenese und Reparaturmechanismen)
Verschiedene Arten von DNA-Polymerasen bei Escherichia coli
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| Bezeichnung | Aufbau | Biochemische Funktion | Funktion der Zelle |
|---|---|---|---|
| DNA-Polymerase I | 1 Untereinheit 928 Aminosäuren 103 Kilodalton (kDa) | DNA-Polymerase 3' - 5' -Exonuclease 5'-3'-Exonuclease | Entfernung von RNA-Primer; Reparatur von DNA-Schäden |
| DNA-Polymerase II | 88 kDa | DNA-Polymerase | Reparatur |
| DNA-Polymerase III | 10 Untereinheiten (ca. 900 kDa) | DNA-Polymerase | Replikations-Polymerase |
Verschiedene DNA-Polymerasen bei eukaryontischen Zellen
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| DNA-Polymerase | katalytische Untereinheit | andere Untereinheiten | 3'-5'-Exonuclease | Hauptfunktion |
|---|---|---|---|---|
| α | 180 Kilodalton (kDa) | 86 kDa 58 kDa 48 kDa | nein | Komplex mit Primase, Synthese kurzer DNA-Stücke |
| β | 40 kDa | keine | nein | Reparatur von DNA |
| γ | 125 kDa | 50 kDa | ja | mitochondriale DNA-Replikation |
| δ | 125 kDa | 53 kDa | ja | Replikation, Reparatur |
| ε | 200 kDa | mehrere | ja | Replikation, Reparatur |
Die grundlegende Reaktion der DNA-Polymerasen ist immer dieselbe: Das Enzym katalysiert den nucleophilen Angriff der 3'-Hydroxylgruppe des Nucleotides am 3'-Ende des wachsenden DNA-Stranges auf das 5' a-Phosphoratom des anzuhängenden 2'-Desoxynukleotid-5'-triphosphats:
Bildquelle: Lehninger: "Prinzipien der Biochemie" 2. Auflage,Spektrum Akademischer Verlag, ISBN 3-86025-106-6
Die allgemeine Reaktionsgleichung lautet:
Mit dNMP und dNTP sind die Desoxy-Nukleotidmono- bzw. triphosphate gemeint.
Für die Polymerisation (Verlängerung) sind zwei zentrale Voraussetzungen notwendig:
- Es braucht eine Matrize (Erklärung dazu im Unterkapitel "Allgemeines")
- Es ist ein Primer (Startermolekül) erforderlich
Ein Primer ist ein kurzer Nukleinsäurestrang mit einer freien 3'-Hydroxylgruppe am Ende. DNA-Polymerasen können nur Nukleotide an einen bereits vorhandenen Strang anfügen, nicht aber die Synthese eines neuen Stranges starten.
Prozessivität: Wenn die DNA-Polymerase an einen Primer gebunden und das erste Nukleotid angehängt hat, gibt es für sie zwei Möglichkeiten: entweder sie dissoziiert ab und lagert sich später wieder an oder sie bewegt sich auf der Matrize vorwärts und hängt weitere Nukleotide an. Diese Eigenschaften wird als Prozessivität einer Polymerase definiert: Der Grad der Prozessivität ist durch die Anzahl Nukleotide gegeben, die die Polymerase im Durchschnitt an den neuen Strang anhängt, bevor sie abdissoziiert. Die Prozessivität wird durch Anlagerung eines Proteinkomplexes an die DNA-Polymerase gesteuert.
Überlegen Sie sich, was die Prozessivität einer Polymerase steigern könnte. In der Lösung finden Sie die Angaben bezüglich der Prozessivität der drei DNA-Polymerasen von E. coli.
Lösung
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Lösung zur FrageDie Prozessivität einer Polymerase hängt von der Dauer der Bindung an die Matrize ab. Je länger sie bindet, desto grösser ist die Zahl der angehängten Nukleotide und damit die Prozessivität. Als Beispiel sollen die DNA-Polymerasen von Escherichia coli dienen:
| Prozessivität (angehängte Nukleotide vor dem Abdissoziieren) | Polymerisationsgeschwindigkeit (angehängte Nukleotide / Sekunde) | |
| Polymerase I | 3-200 | 16 - 20 |
|---|---|---|
| Polymerase II | > oder = 10'000 | ca. 7 |
| Polymerase III | > oder = 500'000 | 250 - 1'000 |
Energieverhältnisse bei der Polymerisation
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Energieverhältnisse der Polymerisation:Bei der Polymerisationsreaktion finden grundsätzlich zwei Reaktionen statt; einerseits wird ein Phosphorsäureanhydrid hydrolysiert (im Desoxynukleotidtriphosphat, dNTP, von welchem Pyrophosphat abgespalten wird) und andererseits wird eine Phosphodiesterbindung gebildet und zwar an der 3'-OH Gruppe der neusynthetisiertenen DNA. Die Zucker-Phosphat-Bindung, welche neu geknüpft wird, ist energiearm, also in der Grössenordnung von 10-15kJ/mol: soviel ist aufzuwenden (+), wenn sie neu gemacht wird, soviel wird frei (-), wenn sie hydrolysiert wird. Die Polymerase hydrolysiert eine energiereiche Anhydridbindung und stellt damit gegen -30kJ/mol zur Verfügung. Es sollten also ca. -15kJ/mol freie Energie "übrigbleiben", wenn ein neues Nukleotid in die wachsende Kette eingefügt wird. Es ist aber sogar mehr! Basenpaarung und Basenstapelung tragen zur Sabilisierung der eingebauten Base bei: sie tragen um die -10kJ/mol freie Energie bei. Die Kopplung dieser Reaktionen bewirkt eine starke thermodynamische Triebkraft in Richtung der Polymerisation mit einem ΔG°von insgesamt etwa -25kJ mol-1.
Genauigkeit: Die DNA-Polymerasen arbeiten sehr exakt: Bei E. coli tritt nur bei jedem 109 bis 1010 Einbau eines Nukleotids ein Fehler auf.
Das Genom von E. coli hat ca. 4.6x106 Basenpaare. Wieviele Replikationen des Genoms können stattfinden, bis ein Fehler auftritt?
Lösung
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Bei E. coli kommt alle 1'000 bis 10'000 Replikationen ein Fehler vor
Während der Polymerisation beruht die Unterscheidung zwischen "richtigen" und "falschen" Nukleotiden auf den Wasserstoffbrücken, die eine korrekte Paarung zwischen den komplementären Basen festlegen. Falsche Basen können nicht die richtigen Wasserstoffbrücken bilden und werden damit zurückgewiesen. Dies allein reicht aber noch nicht aus, um die hohe Präzision der Polymerisation zu erklären. Die Fehlerrate wird in vivo durch zusätzliche enzymatische Mechanismen weiter reduziert, z.B. durch die 3'-5'-Exonuclease-Aktivität. Sie ist eine eigenständige Aktivität der Polymerase. Diese Nukleaseaktivität ermöglicht es dem Enzym, ein gerade eingebautes Nukleotid wieder zu entfernen. Wenn ein falsches Nukleotid eingebaut wurde, ist die Weiterbewegung der Polymerase zur Bindungsstelle des nächsten Nukleotids blockiert. Durch die 3'-5'-Exonucleasewirkung wird das falsche Nukleotid entfernt und das korrekte Nukleotid eingebaut. Diese Funktion wird als Korrekturlesen bezeichnet.
Zu Korrekturmechanismus der DNA-Polymerase (im Kapitel: "Mutation, Mutagenese und Reparaturmechanismen")
Die Richtung der Replikation
Wir haben gesehen, dass ein Nukleotid immer an die 3'-Hydroxylgruppe des neuen Stranges angehängt wird und die neue Kette somit in 5'-3'-Richtung wächst. Diese Tatsache führt aber zu einem Problem:
Wenn die Synthese immer in 5'-3'-Richtung vorwärtsschreitet, wie können dann beide DNA-Stränge gleichzeitig synthetisiert werden?
Stellen wir uns eine Replikationsgabel vor. Der Eltern-Doppelstrang wird aufgetrennt und dient als Matrize. Die beiden Stränge weisen aber nicht dieselbe Orientierung auf: da sie antiparallel angeordnet sind, weist der eine Strang eine 3'-5'-Orientierung auf und der andere eine 5'-3'-Orientierung. Sehen wir uns zuerst den 3'-5'-Elternstrang an, dieser kann in 5'-3'-Richtung direkt repliziert werden (gestrichelt):
Der 5'-3'-Strang aber hat die "falsche" Richtung. Reiji Okazaki fand in den 60er Jahren heraus, dass an diesem Strang viele kurze Stücke in 5'-3'-Richtung synthetisiert werden, welche man nach ihm als Okazaki-Fragmente bezeichnet. Die Länge dieser Fragmente hängt vom Zelltyp ab und beträgt einige hundert bis zweitausend Nucleotide:
Somit wird der eine Strang kontinuierlich (Leitstrang) und der andere diskontinuierlich (Folgestrang) synthetisiert. Der kontinuierliche Strang ist derjenige, bei welchem die Synthese des neuen Stranges in der gleichen Richtung läuft wie die Replikationsgabel. Beim diskontinuierlichen Strang läuft die Synthese in die Gegenrichtung der Replikationsgabel.
Vorgänge in der Replikationsgabel
Bei der Replikation wirken in der Replikationsgabel neben der Polymerasen noch viele weitere Enzyme und Proteine mit, welche in ihrer Gesamtheit als DNA-Replikase-System resp. Replisom bezeichnet werden.
RNA-Primase / DNA-Ligase
Zu Beginn der Replikation wird ein Primer benötigt. Am Leitstrang kann von diesem Primer aus der neue Strang kontinuierlich gebildet werden, da immer ein basengepaartes Kettenende für die weitere Synthese zur Verfügung steht. Am Folgestrang jedoch kann die Polymerase nur eine kurze Zeit lang wirken, dann muss der Polymerisationsprozess weiter vorne von neuem beginnen. Dafür ist jedes Mal von neuem ein Primer nötig. Dieser basengepaarte Primer-Strang wird durch ein Enzym, die RNA-Primase, synthetisiert. Bei Eukaryonten haben die Primer eine Länge von ungefähr 10 Nucleotiden. Diese RNA-Stücke werden in Abständen am Folgestrang synthetisiert und anschliessend durch die DNA-Polymerase zu einem Okazaki-Fragment verlängert. Diese Synthese endet am 5'-Ende des vorhergehenden Fragments. Damit nun ein kontinuierlicher Strang entsteht, der keine RNA-Stücke enthält, tritt noch während der Replikation ein Reparaturmechanismus in Aktion: Eine RNase H (in E. coli Teil der DNA-Polymerase I) entfernt die RNA-Primer und eine DNA-Polymerase füllt die entstandene Lücke mit DNA.
Die DNA-Ligase schliesst dann die Bindung vom 3'-Ende des neuen zum 5'-Ende des alten DNA-Stückes und beendet damit den Vorgang.
Abbildung
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Das DNA-Replikase-System (Replisom)
Bildquelle: Alberts et al,: "Molekularbiologie der Zelle", VCH,2. Auflage 1990, ISBN 3-527-27983-0 und 3. Auflage 1995,
ISBN 3-527-30055-4
DNA-Ligasen
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DNA-Ligasen bei Bakterien und Eukaryonten:E. coli besitzt eine, Eukaryonten mindestens zwei verschiedene DNA-Ligasen.
Ihre Funktion ist dieselbe, sie unterscheiden sich aber im Cofaktor. Während die Bakterien-Ligase NAD als Cofaktor benötigt, ist der Cofaktor von Eukaryonten-Ligasen ATP. Mechanismus:
- AMP (aus ATP oder NAD) bindet an die Lysin-Seitenkette des Enzyms
- Übertragung des AMP-Restes auf das 5'-Phosphatende der DNA
- Bildung der Phosphodiester-Bindung über den Angriff der 3'-OH-Gruppe auf das aktivierte 5'-Phosphatende
Bildquelle: Knippers R.: "Molekulare Genetik", 6. neubearbeitete Auflage 1996,Georg Thieme Verlag Stuttgart - New York, ISBN 3-13-477006-7
DNA-Helicasen
Damit die Replikation überhaupt ablaufen kann, muss der DNA-Doppelstrang (Elternstrang) getrennt werden. Dies bedeutet Schmelzen der DNA über einen kurzen Bereich. Das Entwinden wird von den DNA-Helicasen katalysiert, Enzymen, welche sich entlang der DNA bewegen und die Stränge mittels chemischer Energie aus ATP voneinander trennen. Die freiliegenden DNA-Stränge werden durch DNA-bindende-Proteine stabilisiert.
Mechanismus
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DNA-Helicasen:Die DNA-Helicasen bewegen sich entlang eines DNA-Stranges und lösen die Wasserstoffbrücken zwischen den komplementären Basenpaaren. Dabei nutzen sie die Energie aus der Hydrolyse von ATP. Bei dieser Hydrolyse kann die Form des Proteinmoleküls cyclisch verändert werden, so dass es mechanische Arbeit verrichten kann. Die DNA-Helicasen nutzen dieses Prinzip, um sich schnell auf einem DNA-Einzelstrang fortbewegen zu können. Wenn sie auf einen Doppelstrang treffen, laufen sie auf demselben Strang weiter und winden dabei die Helix auseinander. In Eukaryonten sowie Prokaryonten (E. coli) wurden bisher eine ganze Reihe von verschiedenen DNA-Helicasen gefunden.
Die Einteilung der Helicasen erfolgt biochemisch nach der Polarität ihrer Bewegung (3'-5' oder 5'-3') oder nach Art des Substrats. Viele Helicasen benötigen beispielsweise überstehende Einzelstrangenden als Eintrittsstellen, während andere von Doppelstrangenden aus wirken können.
Die Einteilung nach Funktion ist interessanter, da Helicasen an allen Reaktionen beteiligt sind, die zumindest vorübergehend eine DNA-Einzelstrang-Region verlangen. Es gibt spezifische Helicasen für die DNA-Reparatur, für die Rekombination und für andere genetische Prozesse:
| Bezeichnung | Richtung | Funktion |
|---|---|---|
| DNA-Helicase | 5'-3' | konjugativer DNA-Transfer |
| DNA-Helicase II | 3'-5' | Reparatur von DNA |
| DNA B-Protein | 5'-3' | Replikation |
| Rep-Protein | 3'-5' | Replikation bestimmter Einzelstrang DNA-Phagen; unbekannte Funktion in nicht-infizierten Bakterienzellen |
DNA-Topoisomerasen
Das Auftrennen der Stränge erzeugt topologisch bedingte Spannungen in der helicalen DNA-Struktur: Diese werden durch die Wirkung von Topoisomerasen beseitigt. Die Mithilfe bei der Replikation ist aber nur eine von vielen Aufgaben der Topoisomerasen. Bei allen Reaktionen, bei denen die Topologie der DNA verändert wird, spielen die Topoisomerasen eine wichtige Rolle, also zum Beispiel bei der Transkription von Genen, bei der Rekombination u.a.
Topoisomerasen öffnen vorübergehend den Phosphodiester-Rückgrat der Doppelhelix, leiten den einen DNA-Strang durch die entstandene Lücke und stellen dann die Phosphodiesterbindung wieder her. Das Ergebnis dieser Reaktion ist die Änderung der Windungszahl pro Längeneinheit und damit der Topologie der DNA. Im Wesentlichen arbeiten die Topoisomerasen der Eukaryonten und der Prokaryonten gleich.
Prinzip
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Weitere Informationen über die verschiedenen Topoisomerasen
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Topoisomerasen von Eukaryonten und ProkaryontenBiochemisch werden die Topoisomerasen in zwei Klassen eingeteilt:
- Typ I DNA-Topoisomerasen (Topoisomerase I)
- Typ II DNA-Topoisomerasen (Topoisomerase II)
Topoisomerase I
Die Topoisomerase I überführen superhelikale DNA in entspannte DNA, indem sie einen der beiden Stränge vorübergehend spalten. Als Folge verändert sich die Verknüpfungszahl um eine Windung. Zuerst wollen wir uns die Einzelschritte der Topoisomerase I der Bakterien genauer anschauen:
- Bindung an die negativ superhelikale DNA
- Öffnung von einem der beiden Stränge. Das Enzym bindet kovalent an das 5'- Phosphat des gespaltenen DNA-Stranges
- Der intakte Strang wird durch den DNA-Spalt geführt
- Abtrennen des Enzyms und gleichzeitiger Wiederverschluss der Phosphodiesterbindung
Die Topoisomerase I der Eukaryonten durchläuft einen ganz ähnlichen Reaktionszyklus. Der Unterschied liegt darin, dass das Enzym der Eukaryonten sowohl an negativ wie auch an positiv superhelikale DNA binden kann, und dass zwischenzeitlich eine kovalente Bindung an ein 3'-Phosphat erfolgt.
Topoisomerase II
Die Topoisomerase II spaltet vorübergehend beide DNA-Stränge und ändert damit die Topologie der DNA-Doppelhelix um zwei Windungen. Für ihre Funktion benötigt sie biochemische Energie in Form von ATP. Sie besteht immer aus mehreren Untereinheiten:
Die bakterielle Topoisomerase II hat vier Untereinheiten, je zwei A- und zwei B-Untereinheiten. Sie wird Gyrase genannt. Sie kann negativ superhelikale DNA entspannen, wobei sie dabei kein ATP verbraucht, und sie kann auch negative Supercoils in ringförmige DNA einführen, wobei sie jedoch ATP verbraucht.
Die eukaryontische Topoisomerase II besteht aus zwei identischen Untereinheiten. Sie kann nur "Entspannen", aber dies sowohl mit positiv als auch mit negativ superhelikaler DNA.
Die Topoisomerase II ist fähig, DNA-Ringe, die wie Glieder einer Kette aneinander hängen, durch Schneiden und Wiederverknüpfen voneinander zu lösen. Diese Reaktion erfolgt über folgende Teilschritte:
- Die Topoisomerase II bindet an die DNA. Die eukaryontische Topoisomerase II bevorzugt dabei AT-reiche Sequenzen
- Der gebundene DNA-Doppelstrang wird geschnitten. Dabei entstehen kurze überstehende Einzelstrangenden, deren Phosphatgruppen kovalent an eine OH-Gruppe in einer Enzymuntereinheit gebunden werden
- Der intakte Strang tritt durch die Öffnung im geschnittenen Strang
- Die DNA-Lücke wird durch die Lösung der kovalenten Protein-DNA Bindung wieder verschlossen.
Ausser diesen beiden Haupttypen gibt es noch andere Topoisomerasen, die ähnlich wie die Topoisomerase II funktionieren. Etwaige Spannungen in replizierender DNA von Säuger- oder Bakterien-Zellen werden normalerweise durch die Topoisomerase I aufgelöst. Bei Hefemutanten, welche keine Topoisomerase I haben, kann die Topoisomerase II deren Funktion übernehmen. Die Topoisomerasen sind für das Überleben der Eukaryonten- und Prokaryonten-Zellen lebensnotwendig, da sie für entscheidende Vorgänge am Ende einer Replikationsrunde verantwortlich sind. Dazu hat sie eine wichtige Funktion bei der Kondensation der Chromosomen während der Mitose.
Die Topoisomerasen werden im Kapitel "Struktur von Nukleinsäuren" im Unterkapitel "Superstruktur" auch erwähnt.
Worin liegt der Unterschied in der Funktion einer DNA-Topoisomerase und einer DNA-Helicase?
Lösung
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Die Topoisomerase überwindet die Superwindung der DNA, indem sie den einen Strang spaltet, abwickelt und wieder verschliesst. Damit macht sie die DNA der Helicase zugänglich, die nun die Stränge voneinander trennen kann.