Mechanismus
Die wesentlichen Vorgänge in der Replikationsgabel in Bakterien:
- Die DNA-B-Helicase bewegt sich in 5'-3'-Richtung entlang des Stranges, an den sie gebunden ist und entwindet die Doppelhelix unter Verbrauch von ATP.
- Die entstehenden Einzelstrang-Bereiche werden durch Einzelstrang-bindende-Proteine (SSB-Proteine) abgedeckt.
- Die DNA-Polymerase III heftet auf dem Leitstrang (Vorwärtsstrang) neue Desoxynukleotide an das 3'-OH-Ende des wachsenden DNA-Stranges.
- Auf dem Folgestrang (Rückwärtsstrang) bildet die Primase kurze RNA-Stücke (Primer), welche durch die DNA-Polymerase III zu Fragmenten von 1000-2000 Nukleotiden verlängert werden. Die Primer werden von der 5'-3'-Exonuclease der Polymerase I entfernt und die entstehenden Lücken durch DNA ersetzt
- Die DNA-Ligase verknüpft aufeinanderfolgende Okazaki-Fragmente miteinander.
Einfaches Schema:
Bildquelle: Knippers R.: "Molekulare Genetik", 6. neubearbeitete Auflage 1996, Georg Thieme Verlag Stuttgart - New York, ISBN 3-13-477006-7
Initiation
Bei einer Replikationsgabel handelt es sich um eine DNA-Region, in welcher sich die beiden Elternstränge voneinander getrennt haben, um als Matrize für die DNA-Synthese zu dienen. Sie entstehen an besonderen DNA-Sequenzen, den Replikations-Startpunkten (Origins), welche um die 300 Nukleotide lang sind.
Initiator-Protein-Komplexe binden an spezifische Stellen am Replikationsstartpunkt. Sie bilden einen grossen Proteinkomplex, welcher die DNA-Helicase bindet und sie zu einem freiliegenden DNA-Einzelstrang dirigiert. Zusätzlich bindet die RNA-Primase und bildet mit der Helicase das Primosom, welches sich dann vom Startpunkt wegbewegt und RNA-Primer für die erste DNA-Kette bildet. Daraufhin lagern sich rasch die übrigen Proteine zu einem Replikations-Proteinkomplex zusammen, der sich vom Startpunkt wegbewegt und zwei neue DNA-Stränge (kontinuierlich/diskontinuierlich) synthetisiert.
Schema
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Bildquelle: Knippers R.: "Molekulare Genetik", 6. neubearbeitete Auflage 1996,
Georg Thieme Verlag Stuttgart - New York, ISBN 3-13-477006-7
DNA-Replikationsgabeln werden bei Bakterien an speziellen DNA-Sequenzen initiiert. Von diesen Punkten aus bewegen sich zwei Replikationsgabeln in entgegengesetzter Richtung mit einer Geschwindigkeit von etwa 500 Nukleotiden pro Sekunde. Das Genom der Bakterien ist so klein, dass diese zwei Replikationsgabeln das gesamte Chromosom innerhalb von weniger als 40 Minuten replizieren können.
Bei den Eukaryonten ist die DNA im Kern als Chromatin organisiert ist. Deshalb wird die Replikation der DNA von Veränderungen in der Chromatinstruktur begleitet:
- Entfaltung des Chromatins in der Umgebung der Replikationsgabeln
- Nucleosomen unmittelbar vor der Replikationsgabel verlieren ihre Histon H2A/H2B-Dimere, während die verbleibenden Histon H3/H4-Tetramere auf die neu replizierte DNA übertragen werden. Hinter der Replikationsgabel werden die Tetramere durch Aufnahme von Histon H2A/H2B wieder zu intakten Nucleosomen zusammengefügt.
- Auf der alten DNA werden neu gebildete Histone H3/H4 mit den H2A/H2B Histonen zusammengebaut und neue Nucleosomen gebildet. Somit sind die Nucleosomen auf der replizierten DNA zur Hälfte aus den alten Histonen (des parentalen Stranges) und aus neu gebildeten Histonen zusammengesetzt.
Die Geschwindigkeit mit der sich die Replikationsgabel von Eukaryonten bewegt, liegt bei ca. 50 Nukleotiden pro Sekunde, und das Genom ist etwa 1000 mal grösser. Daraus ergibt sich die Notwendigkeit, die Replikation von mehreren Replikationsstartpunkten aus zu beginnen, da die Replikation sonst mehrere Wochen dauern würde:
- Es werden immer mehrere Initiationspunkte aktiviert.
- Die Initiationspunkte haben einen Abstand von 30'000 - 300'000 Basenpaaren
- Die Replikationsgabeln bewegen sich von einem gemeinsamen Startpunkt weg und stoppen, wenn sie mit einer anderen Replikationsgabel zusammenprallen. Auf diese Weise können viele Replikationsgabeln gleichzeitig und unabhängig auf jedem Chromosom operieren und dabei zwei komplette Tochter-DNA-Helices synthetisieren.
Schema:
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Bildquelle: Alberts et al,: "Molekularbiologie der Zelle", VCH, 2. Auflage 1990, ISBN 3-527-27983-0und 3. Auflage 1995, ISBN 3-527-30055-4
Termination
Prokaryoten: Bei der Termination treffen am Terminator zwei Replikationsgabeln aufeinander. Dadurch kann es bei ringförmiger DNA (E. coli) zur Ausbildung von sog. Catenan-Strukturen kommen. Der Terminator liegt gegenüber dem Origin. An die Terminatorsequenz bindet das Protein Tus (terminator utilization substance), das die DNA-Helicase blockiert und damit die Wanderung der Replikationsgabeln zum Stillstand bringt.
Die beiden Nachkommen-DNA hängen noch über einen unreplizierten Abschnitt zusammen. Dieser kann direkt durch die Einwirkung einer Topoisomerase gelöst werden. Die entstehenden Lücken werden sofort aufgefüllt (Schema)
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Bildquelle: Knippers R.: "Molekulare Genetik",6. neubearbeitete Auflage 1996, Georg Thieme Verlag Stuttgart - New York,
ISBN 3-13-477006-7
Oft beobachtet man aber eine weitergehende DNA-Synthese mit der Ausbildung von Catenanen (ineinander verhängte Ringe). Zur Auflösung der Catenane und zur Freisetzung der replizierten DNA ist die Typ-II-Topoisomerase notwendig (Mechanismus)
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Topoisomerasen von Eukaryonten und ProkaryontenBiochemisch werden die Topoisomerasen in zwei Klassen eingeteilt:
- Typ I DNA-Topoisomerasen (Topoisomerase I)
- Typ II DNA-Topoisomerasen (Topoisomerase II)
Topoisomerase I
Die Topoisomerase I überführen superhelikale DNA in entspannte DNA, indem sie einen der beiden Stränge vorübergehend spalten. Als Folge verändert sich die Verknüpfungszahl um eine Windung. Zuerst wollen wir uns die Einzelschritte der Topoisomerase I der Bakterien genauer anschauen:
- Bindung an die negativ superhelikale DNA
- Öffnung von einem der beiden Stränge. Das Enzym bindet kovalent an das 5'- Phosphat des gespaltenen DNA-Stranges
- Der intakte Strang wird durch den DNA-Spalt geführt
- Abtrennen des Enzyms und gleichzeitiger Wiederverschluss der Phosphodiesterbindung
Die Topoisomerase I der Eukaryonten durchläuft einen ganz ähnlichen Reaktionszyklus. Der Unterschied liegt darin, dass das Enzym der Eukaryonten sowohl an negativ wie auch an positiv superhelikale DNA binden kann, und dass zwischenzeitlich eine kovalente Bindung an ein 3'-Phosphat erfolgt.
Topoisomerase II
Die Topoisomerase II spaltet vorübergehend beide DNA-Stränge und ändert damit die Topologie der DNA-Doppelhelix um zwei Windungen. Für ihre Funktion benötigt sie biochemische Energie in Form von ATP. Sie besteht immer aus mehreren Untereinheiten:
Die bakterielle Topoisomerase II hat vier Untereinheiten, je zwei A- und zwei B-Untereinheiten. Sie wird Gyrase genannt. Sie kann negativ superhelikale DNA entspannen, wobei sie dabei kein ATP verbraucht, und sie kann auch negative Supercoils in ringförmige DNA einführen, wobei sie jedoch ATP verbraucht.
Die eukaryontische Topoisomerase II besteht aus zwei identischen Untereinheiten. Sie kann nur "Entspannen", aber dies sowohl mit positiv als auch mit negativ superhelikaler DNA.
Die Topoisomerase II ist fähig, DNA-Ringe, die wie Glieder einer Kette aneinander hängen, durch Schneiden und Wiederverknüpfen voneinander zu lösen. Diese Reaktion erfolgt über folgende Teilschritte:
- Die Topoisomerase II bindet an die DNA. Die eukaryontische Topoisomerase II bevorzugt dabei AT-reiche Sequenzen
- Der gebundene DNA-Doppelstrang wird geschnitten. Dabei entstehen kurze überstehende Einzelstrangenden, deren Phosphatgruppen kovalent an eine OH-Gruppe in einer Enzymuntereinheit gebunden werden
- Der intakte Strang tritt durch die Öffnung im geschnittenen Strang
- Die DNA-Lücke wird durch die Lösung der kovalenten Protein-DNA Bindung wieder verschlossen.
Ausser diesen beiden Haupttypen gibt es noch andere Topoisomerasen, die ähnlich wie die Topoisomerase II funktionieren. Etwaige Spannungen in replizierender DNA von Säuger- oder Bakterien-Zellen werden normalerweise durch die Topoisomerase I aufgelöst. Bei Hefemutanten, welche keine Topoisomerase I haben, kann die Topoisomerase II deren Funktion übernehmen. Die Topoisomerasen sind für das Überleben der Eukaryonten- und Prokaryonten-Zellen lebensnotwendig, da sie für entscheidende Vorgänge am Ende einer Replikationsrunde verantwortlich sind. Dazu hat sie eine wichtige Funktion bei der Kondensation der Chromosomen während der Mitose.
Eukaryoten: Telomere und Telomerase: Da eukaryontische Chromosomen linear sind, stellt die Replikation der Enden ein besonderes Problem dar. Eine einfache Überlegung zeigt, dass die von Primern vermittelte diskontinuierliche DNA-Synthese quasi automatisch zu einem Verlust endständiger DNA führen muss, weil zumindest der DNA-Abschnitt, an dem die Synthese des letzten RNA-Primers stattfindet, unrepliziert bleiben muss.
Die Lösung dieses Problems ist durch die besondere Struktur der Chromosomen-Enden (Telomere) möglich:
Telomere bestehen aus Folgen kurzer repetitiver DNA-Sequenzen. An den Enden der Chromosomen des Menschen und anderer Vertebraten findet man viele hundert bis über tausend 6-Nukleotid-Blöcke vor: z.B. die Folge 5'-TTAGGG-3' in monotonen Wiederholungen auf dem einen DNA-Strang und die entsprechende Komplementär-Sequenz auf dem anderen DNA-Strang. Die Telomere werden im Verlauf der vielen Replikationsrunden von normalen Säugetierzellen in Zellkultur und im Tier kürzer. Es handelt sich dabei um einen normalen und unvermeidlichen Alterungsprozess. Reifende Geschlechtszellen, Embryonalzellen, Zellen aus Tumoren und alle schnell proliferierenden Zellen dagegen enthalten ein Enzym, das den Abbau der Telomerenden ausgleicht. Das Enzym heisst Telomerase.
Telomerase besteht aus zwei funktionellen Teilen, einem Proteinanteil und einer RNA von etwa 160 Basen. Die RNA enthält einen Sequenzabschnitt, der mit den Telomer-Wiederholungen Basenpaare ausbilden kann. Die RNA dient gleichsam als wandernde Matrize für die Synthese von Telomeren, wie aus dem folgenden Reaktionsablauf hervorgeht:
- Es bilden sich Basenpaare zwischen dem überstehenden DNA-Ende und der Telomerase-RNA
- Desoxynukleotide werden an das 3'-OH-Ende der DNA nach Massgabe der Matrizensequenz in der RNA angeheftet
- Es findet eine Translokation der Telomerase mit der Bereitstellung neuer Matrizensequenzen statt
Abbildung
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Termination:Die RNA der Telomerase enthält einen Abschnitt, der Basenpaarungen mit der Telomer-Sequenz eingehen kann. Überstehende RNA-Sequenzen dienen als Matrize für die DNA-Polymerisierung. Dann bewegt sich das Enzym um die Länge einer Telomer-Einheit weiter, Translokation, und der Syntheseschritt wiederholt sich.
Bildquelle: Knippers R.: "Molekulare Genetik", 6. neubearbeitete Auflage 1996,Georg Thieme Verlag Stuttgart - New York, ISBN 3-13-477006-7